Vreau să încep cu o reamintire care se pierde adesea în discuțiile publice: Vaccinurile ARNm anti-Covid sunt produse medicale cu adevărat inovatoare.
Înainte de autorizațiile de urgență din 2020, tehnologia vaccinurilor ARNm nu fusese niciodată implementată la scară largă la om. Doar două studii clinice, unul de la Pfizer-BioNTech și unul de la Moderna, au testat vreodată această platformă la oameni. În total, aproximativ 37,000 de persoane au primit vreodată un vaccin ARNm în istoria medicinei (fără a include experiența anterioară cu vaccinurile împotriva rabiei, CMV și cancerului, limitată la studii mult mai mici, în fază incipientă). Aceasta nu este o critică; este pur și simplu o afirmație de fapt. Dar înseamnă că profilul de siguranță pe termen lung al acestor produse a fost și rămâne incomplet înțeles.
Ceea ce urmează este familiar aproape tuturor biologilor moleculari. Este complicat, dar încerc să simplific, având în vedere miza. Este important să se prezinte clar cadrul molecular pentru toată lumea, deoarece modul în care sunt fabricate aceste vaccinuri determină direct ce se află în interiorul flaconului.. Iar ceea ce se află în interiorul fiolei, odată injectat, va călători prin corp și va activa o cascadă de evenimente care pot duce la implicații pe termen lung asupra sănătății.
Transcripția in vitro nu este doar un detaliu de fabricație
Vaccinurile cu ARNm modificat sunt produse folosind un proces numit transcripție in vitro (IVT))IVT este metoda utilizată pentru sintetizarea ARNm modificat care devine în cele din urmă ingredientul activ din vaccin.
Aceasta nu este o tehnică banală. IVT modelează fundamental compoziția moleculară a produsului final.
Oamenii de știință de la BioNTech, inclusiv cei implicați direct în dezvoltarea vaccinului Pfizer, au publicat o analiză detaliată1 descrie modul în care reacțiile IVT generează nu doar ARNm-ul complet dorit, ci și o gamă de produse secundare și impurități, cum sunt acestea îndepărtate de obicei și care pot fi consecințele lor biologice dacă persistă. Aceste direcții de fabricație, împreună cu produsele secundare pe care le creează, au fost, de asemenea, descrise în detaliu de Moderna în brevetele lor (US10,653,712 B2 și US10,077,439 B2). Dar, mai important, această biologie moleculară a fost bine stabilită cu mult înainte de Covid. Nimic din toate acestea nu este speculativ.
Materialul de pornire: șabloane de ADN
În esență, o reacție IVT începe cu ADN bicatenar care codifică proteina dorită. În acest caz, proteina spike a SARS-CoV-2.
Secvența care codifică spike-ul utilizată în vaccinurile ARNm este modificate genetic pentru a îmbunătăți stabilitatea și toleranța celulară, inclusiv două substituții de aminoacizi care o disting de vârful viral. Această modificare este intenționat.
Șablonul ADN în sine poate lua diferite forme. În timpul studiilor clinice timpurii ale Pfizer, s-au folosit fragmente de ADN generate prin PCR. Cu toate acestea, procesul de fabricație comercial se baza pe ADN derivat din plasmide. Acest lucru este important deoarece plasmidele conțin secvențe reglatoare suplimentare. În cazul Pfizer, acestea includ elemente precum promotorul SV40 și secvențele ori, care ridică îngrijorări dacă ar pătrunde în celulele umane.
Odată ce acest șablon de ADN este adăugat la reacția IVT, împreună cu ARN polimeraza și alte componente, acesta este transcris în ARNm (Figura 1).
IVT produce subproduse prin designDeși rezultatul dorit al IVT este produsul ARNm integral dorit, rezultatul real este mai complex. Acestea includ diverse produse secundare sub formă de (1) diverse specii de ARN, inclusiv ARN bicatenar (dsARN), (2) ADN atașat la ARN (hibrizi ARN-ADN) și (3) ADN liber din șablonul original (Figura 2).
Formarea acestor produse secundare este bine documentată și inevitabilă și este motivul pentru care purificarea în aval este absolut esențială pentru siguranță.
Figura 2. Produse secundare și contaminanți din fabricarea TVI. Imagine adaptată de la 1.Purificarea are limitări cunoscute
După fabricare, sunt necesare două etape de purificare pentru a îndepărta mai întâi ADN-ul și apoi produsele secundare de ARN (Figura 3):
Figura 3. Îndepărtarea produselor secundare IVT. Imagine adaptată de la 2.Pentru a îndepărta ADN-ul, în amestecul de reacție se adaugă o enzimă numită DNază I, care este utilizată în mod obișnuit pentru a degrada ADN-ul contaminant. Deși DNaza I este eficientă împotriva ADN-ului matriță liber, studii multiple, inclusiv lucrări ale oamenilor de știință de la BioNTech, arată că DNaza I este ineficientă în îndepărtarea ADN-ului atașat la ARN (hibrizi ARN-ADN).
Această limitare nu este controversată. Este documentată în literatura de specialitate.
Ce au arătat analizele independente
Acest context este crucial pentru interpretarea analizelor independente recente ale flacoanelor de vaccin finalizate.
Cercetatorii3 și autoritățile de reglementare4 au raportat detectarea de contaminanți ADN practic în fiecare fiolă testată. Acești contaminanți au inclus atât ADN bicatenar, cât și hibrizi ARN-ADN care păreau rezistenți la digestia cu DNază I.
În unele probe, ADN-ul care codifică spike-ul a fost prezent la niveluri de peste 100 de ori mai mari decât alte secvențe plasmidice.5, sugerând o digestie inegală sau incompletă. Secvențierea și analizele PCR cantitative au detectat în plus fragmente de ADN cu o lungime medie de ~200 de perechi de baze, unele depășind 4 kilobaze. În mai multe cazuri, s-au observat secvențe care acoperă aproape întreaga plasmidă.
Luate împreună, aceste descoperiri ridică întrebări serioase cu privire la consecvența și completitudinea purificării în timpul producției la scară largă și cu privire la potențialele consecințe biologice ale acizilor nucleici reziduali la oameni.
De ce sunt importanți contaminanții cu acid nucleic din punct de vedere biologic
ARN-ul și ADN-ul sunt activatori puternici ai căilor imune înnăscute. Aceasta nu este o speculație. Receptorii de recunoaștere a tiparelor și calea cGAS-STING răspund robust la acizii nucleici străini, declanșând inflamație, inhibarea creșterii și chiar moartea celulară.
Aceste mecanisme sunt tocmai motivul pentru care produsele de terapie genică sunt supuse unei supravegheri stricte a siguranței.
În mod ironic, vaccinurile ARNm anti-Covid au fost concepute cu modificări specifice pentru a reduce această puternică activare imună înnăscută. Însă hibrizii ARN-ADN și fragmentele de ADN vor provoca în continuare răspunsuri imune puternice în ciuda acestor modificări.
Persistența ridică noi întrebări
Există acum dovezi substanțiale care arată că ARNm-ul și proteinele din spike persistă în țesuturile umane timp de săptămâni, luni și chiar ani după vaccinare (Tabelul 1).
Încă nu știm dacă această persistență reflectă stabilitatea prelungită a ARNm, traducerea continuă sau mecanisme bazate pe ADN. Dar, având în vedere plauzibilitatea integrării ADN-ului și ADN-ul plasmidic neintegrat cu viață lungă în celulele musculare,6 Nu este nerezonabil să presupunem că persistența ARNm, proteinelor și anticorpilor Spike împotriva Spike la ani de la vaccinare nu este fără legătură cu impuritățile și produsele secundare ale ADN-ului care urmează IVT.
Tabelul 1. ARNm-ul spike și persistența proteinelor după vaccinare la omImplicații de siguranță pe termen scurt și lung
Luate împreună, aceste date ridică mai multe considerații importante de siguranță.
În primul rând, au fost raportate reacții imune acute, inclusiv furtuni de citokine și anafilaxie, imediat după vaccinare. Astfel de răspunsuri inflamatorii puternice nu ar trebui respinse complet ca neavând legătură cu impuritățile, în special având în vedere ceea ce se știe despre activarea imună indusă de acidul nucleic.
În al doilea rând, și mai important, sunt riscurile pe termen lung. Expresia persistentă a vârfurilor ar putea contribui în mod plauzibil la sindroame imune cronice. Și mai îngrijorătoare este posibilitatea integrării ADN-ului, care prezintă riscuri de mutageneză inserțională sau perturbare genetică. Aceasta înseamnă un risc de cancer sau defecte de dezvoltare, în funcție de locul și vârsta la care a fost integrat ADN-ul.
În special, FDA însăși declară în fișele sale informative că aceste vaccinuri nu au fost a fost evaluată pentru carcinogenitate (formarea cancerului) sau genotoxicitate (deteriorarea ADN-ului), un aspect care ar fi de rutină și așteptat în supravegherea terapiei genice, unde monitorizarea pe termen lung este standard.
Decalajul de reglementare din jurul ADN-ului în vaccinurile ARNm
Întrucât nu mai există nicio dispută cu privire la existența ADN-ului rezidual în vaccinurile ARNm, problema este dacă ghidurile și limitele de siguranță actuale sunt adecvate pentru vaccinurile ARNm. Ni s-a asigurat că produsele secundare ale ADN-ului se încadrează în limitele stabilite în ghidurile de reglementare. Așadar, care sunt îndrumările FDA privind produsele secundare ale ADN-ului și contaminanții?
Cel mai frecvent citat ghid FDA privind ADN-ul rezidual (≤10 ng per doză) a fost elaborat pentru vaccinurile virale produse în celule vii fragmentate și „nude”, cu capacitate limitată de a pătrunde în celulele umane. Cu toate acestea, vaccinurile ARNm nu sunt produse în celule, ADN-ul lor rezidual nu este derivat din celulele gazdă și, cel mai important, ADN-ul din vaccinurile ARNm nu este nud. Acesta este asociat cu sistemele de administrare a LNP, care facilitează în mod specific pătrunderea ADN-ului în celule. Ghidul FDA din 2010 este clar că nu stabilește un prag de siguranță relevant pentru ADN-ul asociat cu produsele pe bază de LNP.
Celălalt ghid citat frecvent este cel al OMS pentru terapiile cu proteine recombinante care abordează ADN-ul rezidual în produse precum anticorpii monoclonali sau hormonii produși în celule modificate genetic. Și în acest caz, ADN-ul rezidual provine din celulele gazdă sau din plasmidele de expresie, este prezent sub formă de urme de ADN necapsulat (nud), iar produsul final este o proteină purificată, nu o terapie pe bază de acid nucleic (vaccin ARNm). Prin urmare, acest ghid nu se aplică vaccinurilor ARNm.
Nici standardele de reglementare FDA, nici cele ale OMS, cele mai des citate pentru ADN-ul rezidual, nu au fost dezvoltate pentru vaccinuri cu ARNm și nu abordează direct această problemă de siguranță.
Ce a spus OMS despre vaccinurile ARNm — după implementare
În 2022, Organizația Mondială a Sănătății a emis îndrumări specifice privind vaccinurile ARNm7În special, acest document a fost publicat după lansarea globală a acestor produse. Se precizează în mod specific că aceste îndrumări au fost formulate ca răspuns la: „problemele de siguranță, producție și reglementare asociate cu această nouă tehnologie.„Documentul face, de asemenea, câteva afirmații importante:
Deoarece nu sunt încă disponibile informații detaliate cu privire la metodele utilizate pentru producție, controalele nu sunt încă standardizate pentru vaccinurile ARNm sigure și eficiente, iar anumite detalii rămân protejate de drepturi de autor și, prin urmare, nu sunt disponibile publicului, nu este fezabil să se elaboreze ghiduri sau recomandări internaționale specifice în acest moment.Matei 22:21
În plus, se precizează: „Procedurile detaliate de producție și control... ar trebui discutate cu și aprobate de ANR [Autoritatea Națională de Reglementare].] de la caz la caz, în mod individual.Matei 22:21
OMS recunoaște că controalele pentru vaccinurile ARNm nu erau încă standardizate și că nu era fezabil să se stabilească ghiduri sau recomandări internaționale specifice. În plus, este necesară o supraveghere de reglementare pentru evaluarea de la caz la caz de către autoritățile naționale.
Acest lucru a fost afirmat după ce vaccinurile ARNm au fost implementate..
Și la momentul redactării acestui Substack, FDA încă nu a stabilit ghiduri standardizate pentru vaccinurile ARNm și nu a furnizat dovezi și date bazate pe siguranță pentru a susține orice limite ale ADN-ului în vaccinurile ARNm.
În cele din urmă, merită repetat: deși tehnologia ARNm nu este nouă, înainte de Covid, aceasta era reglementată ca terapie genică, nu ca vaccin tradițional. Problemele de siguranță legate de produsele secundare ale ADN-ului din vaccinurile Covid vor fi aceleași cu orice vaccin ARNm, inclusiv cele pentru gripă, VSR sau chiar vaccinurile ARNm pentru cancer.
Acest lucru se datorează faptului că produsele ARNm sunt fundamental diferite. Trebuie să intre în celule și să le instruiască să producă o proteină străină. Acest lucru este diferit de orice alte vaccinuri convenționale care eliberează proteina direct. Nu există niciun precedent clinic pentru această platformă și niciun precedent clinic pentru dozare repetată. Și cu siguranță niciun precedent la scară populațională.
În această etapă, fără o pandemie, fără acumularea de date mecanistice și observații clinice și fără proliferarea produselor vaccinale ARNm care ajung pe piață, avem nevoie de transparență și de o implicare directă în studii serioase de siguranță din partea autorităților de reglementare, în special din partea FDA care stabilește linii directoare critice pentru fabricarea acestor produse - mai ales în ceea ce privește produsele secundare ale ADN-ului.
Tehnologia nouă necesită o analiză inovatoare – nu tăcere, manipulare sau cenzură.
Referinte
1 https://www.frontiersin.org/journals/molecular-biosciences/articles/10.3389/fmolb.2024.1426129/full
2 Webb C, Ip S și colab., Mol Pharm. 4 aprilie 2022;19(4):1047-1058. doi: 10.1021/
3 https://www.tandfonline.com/doi/10.1080/08916934.2025.2551517?url_ver=Z39.88-2003&rfr_id=ori:rid:crossref.org&rfr_dat=cr_pub%20%200pubmed
4 https://www.tga.gov.au/resources/publication/tga-laboratory-testing-reports/summary-report-residual-dna-and-endotoxin-covid-19-mrna-vaccines-conducted-tga-laboratories.
5 https://zenodo.org/records/17832183; https://www.scstatehouse.gov/CommitteeInfo/SenateMedicalAffairsCommittee/PandemicPreparedness/Phillip-Buckhaults-SC-Senate-09122023-final.pdf
6 Wang și colab. (2004) – „Detectarea integrării ADN-ului plasmidic în ADN-ul genomic gazdă după injectarea intramusculară și electroporarea” (Gene Therapy, 2004). La șoareci, ADN-ul plasmidic nud a fost injectat intramuscular, urmat de electroporare pentru a îmbunătăți absorbția. Folosind o PCR extrem de sensibilă pe ADN genomic purificat (cu separare pe gel pentru a elimina formele extracromozomiale), autorii au identificat patru evenimente de integrare independente la 4 săptămâni după injectare. Secvențierea joncțiunii a confirmat situsurile de integrare aleatorii (fără puncte fierbinți preferențiale), în concordanță cu îmbinarea capetelor neomoloage. Frecvența integrării a fost scăzută, dar măsurabilă. Aceasta este una dintre cele mai clare demonstrații ale evenimentelor de integrare spontană reale in vivo pentru ADN-ul plasmidic nud în mușchi. De remarcat – acest studiu a utilizat o livrare îmbunătățită de ADN prin electroporare, pe care o putem compara cu livrarea îmbunătățită prin intermediul LNP-urilor.
Martin și colab. (1999) – „Vaccinul împotriva malariei cu ADN plasmidic: Potențialul de integrare genomică după injecția intramusculară” (Terapie genică umană). Acest studiu anterior a testat ADN plasmidic IM la șoareci și a utilizat hibridizarea Southern blot și PCR pe ADN genomic cu greutate moleculară mare pentru a investiga integrarea. Deși persistența a fost în mare parte extracromozomială, au raportat dovezi care sugerează o integrare rară în unele probe (deși nu secvențiate la fel de definitiv ca lucrările ulterioare). A stabilit un punct de referință pentru risc scăzut, dar a recunoscut potențialul pentru evenimente cu frecvență foarte scăzută, influențând îndrumările ulterioare ale FDA privind vaccinurile ADN.
Ledwith și colab. (2000) – „Vaccinuri cu ADN plasmidic: Investigarea integrării în ADN-ul celular gazdă după injectarea intramusculară la șoareci” (Intervirology). ADN plasmidic simplu injectat intramuscular la șoareci a demonstrat, și deși nu s-a observat nicio integrare detectabilă, ADN-ul a fost încă detectat în mușchiul cvadriceps până la 26 de săptămâni. ADN-ul era extracromozomial.
7 Comitetul de experți al OMS pentru standardizare biologică, cel de-al 74-lea raport, Anexa 3. Evaluarea calității, siguranței și eficacității vaccinurilor cu ARN mesager pentru prevenirea bolilor infecțioase: considerații de reglementare https://cdn.who.int/media/docs/default-source/biologicals/vaccine-standardization/annex-3—mrna-vaccines_who_trs_1039_web-2.pdf
Dr. Charlotte Kuperwasser este o profesoară distinsă în cadrul Departamentului de Biologie a Dezvoltării, Moleculară și Chimică de la Facultatea de Medicină a Universității Tufts și directoarea Laboratorului de Convergență Tufts de la Tufts. Dr. Kuperwasser este recunoscută pe plan internațional pentru expertiza sa în biologia glandelor mamare și cancerul de sân, precum și pentru prevenirea acestuia. Este membră a Comitetului Consultativ pentru Practici de Imunizare.
